Cours
TD Analyse Numérique et probabilité
TD Immunologie cellulaire et moléculaire
TD Biochimie cellulaire et fonctionnelle
TD Enzymologie approfondie
FICHE TD N°1
Exercice n°1 : CALCUL D’ACTIVITES
La lactase hydrolyse le lactose en glucose et galactose.
On détermine la vitesse d’hydrolyse du lactose par la lactase (β-galactosidase) (E.C.3.2.1.23) dans les conditions initiales. Il apparait 0.672x10-2moles de glucose en 10 minutes. On a introduit dans le milieu 1 ml de solution enzymatique dont la teneur en protéines est de 2.85g.L1-
a)Ecrire l’équation de la réaction.
b) Que signifie le terme « conditions initiales », préciser les conditions de concentration en substrat
c) Calculer la concentration d’activité catalytique de la préparation en enzymatique en Ul.mL1-
d) Calculer l’activité spécifique de l’enzyme en Ul.mg1- et en Kat.mg1-.
e)Calculer l’activité molaire spécifique en considérant que l’on est en présence d’une enzyme pure. (PM=135000 Da)
Exercice n°2 : CALCUL D’ACTIVITES
La glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) catalyse la réaction :
D-glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone + NADPH + H+
Dans le globule rouge humain, l’activité enzymatique de la G6PD normale est 1.4UI par ml de globule rouge. D-glucose-6-phosphate restant en excès pendant tout le temps de la mesure, quel sera le temps nécessaire à la conversion 100 µg de D-glucose-6-phosphate (M= 260 g/mole) en 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone, par 0.5ml de globule rouge ?
Exercice n° 3
L’activité d’une enzyme est testée après deux étapes de purification successives :
-étapes 1 :1.2g de protéine sont récupérés dans 50 ml (extrait 1)
-étapes 2 : 0.36g de protéine sont récupérés dans 12 ml (extrait 2).
La dilution de 20 µl de chaque extrait dans 1ml de milieu en réactionnel se traduit par formation de 1.6 micromole (extrait 1) et 5.9 micromoles (extrait 2) de produit par minute.
Question 1 : Quel est le rendement de la purification ?
Question 2 : Quel est le facteur de la purification ?
FICHE TD N°2
TD 02 : ordre de la réaction
Exercice 01 :
La pyruvate déshydrogénase est phosphorylée en présence d’une protéine kinase. Cette phosphorylation peut être mesurée facilement en utilisant de l’ATP marqué en position γ le 32P, et en déterminant l’incorporation de résidus phosphorylé dans la pyruvate déshydrogénase. Le tableau donne le nombre de nanomoles de 32P incorporées en 1 minute, pour différentes quantités de protéine kinase dans l’essai :
|
Protéine kinase (µg) |
2.5 |
10 |
15 |
20 |
|
32P incorporées (nmol/mn) |
0.33 |
1.22 |
1.83 |
2.44 |
Déterminer l’ordre partiel de la réaction par rapport à la protéine kinase
Exercice 02 :
L’activité des enzymes dépend de leur structure 3D, laquelle est maintenue grâce à des forces d’interactions entre groupes chargés, groupes hydrophobes, etc. Lorsque l’on élève la T°, on diminue l’intensité de certaines de ces interactions, ce qui a pour conséquences de déstructurer la protéine et d’entrainer la perte de l’activité enzymatique.On a étudié par chauffage à 55 °C la dénaturation thermique d’une solution d’enzyme 70 nM.Après des temps variables, on a prélevé des volumes aliquotes de la solution dans lesquels on a mesuré l’activité de l’enzyme. Cela a permis de calculer la concentration d’enzyme non dénaturé après différents temps de chauffage :
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Temps à 55°C (min) |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
30 |
60 |
∝ |
|
[Enzyme natif] (nM) |
70 |
52 |
38.5 |
28.5 |
21 |
11.5 |
2 |
0 |
Déterminer l’ordre de la réaction et la constante de la vitesse
Exercice 03 :
La dénaturation thermique de la phosphoglycérate kinase a été étudiée à 44 °C, en mesurant l’activité enzymatique restante dans des quantités aliquotes prélevées après différents temps d’incubation :
|
Temps d’incubation à 44 °C (min) |
0 |
1 |
3 |
5 |
8 |
∝ |
|
Activité enzymatique (%) |
100 |
78 |
46 |
29 |
15 |
0 |
Déterminer l’ordre de la réaction et la constante de vitesse correspondante.
Exercice 04 :
On a extrait de l’électroplaque de gymnote une macromolécule qui est un récepteur de l’acétylcholine. La fixation sur ce récepteur d’une neurotoxine a été étudiée au cours du temps : 13 picomoles de récepteur ont été incubées avec 150 picomoles de neurotoxine radioactive, dans un volume final de 8.35 ml. Après différents temps d’incubation, des parties aliquotes contenant 1.5 picomoles de récepteur étaient prélevées et filtrées sur un filtre capable de retenir le récepteur et la neurotoxine fixée au récepteur. Par mesure de la radioactivité retenues sur les filtres, on a pu calculer le nombre de picomoles de neurotoxine liée au récepteur dans chaque prélèvement :
|
Temps d’incubation (min) |
0 |
1 |
3 |
5 |
7 |
10 |
15 |
60 |
90 |
|
Picomoles fixées |
0 |
0.35 |
0.8 |
1.06 |
1.23 |
1.37 |
1.47 |
1.5 |
1.5 |
Déterminer l’ordre de la réaction et sa constante cinétique.
Exercice 05 :
La modification des thiols d’un enzyme par le DTNB (5.5’-dithiolbos-2-nitro-benzoate) a été suivie par mesure de l’absorbance de l’ion thionitrobenzoate libéré : la réaction entre une molécule de DTNB et un thiol libère un ion TNB, ce qui entraine une variation du coefficient d’extinction molaire de 13600 M-1.cm-1. Le tableau présente les résultats d’une expérience effectuée en présence d’enzyme 10µM et de TDTNB 1mM :
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Temps (min) |
0.5 |
1 |
2 |
3 |
5 |
7.5 |
15 |
20 |
|
Variation d’absorbance |
0.11 |
0.2 |
0.32 |
0.4 |
0.49 |
0.53 |
0.545 |
0.545 |
Déterminer l’ordre de la réaction et la constante de vitesse.
FICHE TD N°3
TD 03 : Inhibiteurs enzymatique
Exercice 01 :
S et I sont respectivement un substrat et un inhibiteur d’une enzyme.
On mesure V (µmole de S consommé par minute) pour différentes concentrations initiales de S en absence et en présence de I
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I absent |
I présent |
|
[S]× 10-3 |
V (µM/mn) |
V(µM/mn) |
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1 1.5 2.5 5 10 20 |
0.290 0.380 0.510 0.690 0.800 0.900 |
0.167 0.230 0.330 0.500 0.670 0.800 |
a) Préciser le type d’inhibition exercée par I sur l’enzyme.
b) Déterminer Km et Vmax, en absence et en présence de I
Exercice 02 :
S et I sont respectivement un substrat et un inhibiteur d’une enzyme.
On mesure V (µmole de S transformé par minute) pour différentes concentrations initiales de S en absence et en présence de I (à la concentration de 10-6)
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|
I absent |
I présent |
|
[S] × 102M |
V (µmole/min) |
V(µmole/min) |
|
2 5 7.5 10 20 |
5 7.14 7.87 8.34 9.09 |
2.5 3.57 3.95 4.17 4.54 |
a) Préciser le type d’inhibition exercée par I sur l’enzyme.
b) Déterminer Km et Vmax, en absence et en présence de I
c) Calculer la constante de dissociation Ki du complexe enzyme-inhibiteur
Exercice 03 :
On a étudié la vitesse de la réaction catalysée par la lactate déshydrogénase hépatique en fonction de la concentration lactate en absence d’oxalate (-OOC-COO-) ou en présence à la concentration de 5mmol/l
La vitesse initiale de la réaction (V) a été exprimée en millimole de pyruvate libéré par litre et par minute. Les résultats obtenus sont les suivants :
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En absence d’oxalate |
En présence d’oxalate |
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Lactate (mmol/l) |
V (mmol/l/min) |
V(mmol/l/min) |
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2.5 3.3 5 10 |
0.0166 0.0200 0.0250 0.0333 |
0.0100 0.0125 0.0166 0.0250 |
a) Calculer la vitesse maximale de la réaction Vm et la constante de Michaelis Km en absence et en présence d’oxalate
b) Quel type d’inhibition représente l’oxalate pour la lactate déshydrogénase. Calculer Ki. Justifier votre réponse.