Introduction

La biodiversité est le résultat des modifications du génome des différentes espèces au cours de l'évolution. Ces modifications chez les  populations bactériennes peuvent poser un problème dans le traitement des infections bactériennes. Car ces dernières ont acquis des gènes de résistance à certaines molécules antibactériennes. Non seulement ces résistances sont un problème, mais les bactéries possèdent des mécanismes permettant le transfert de ces gènes à d’autres bactéries. Ainsi, une résistance (ou une mutation) apparaissant dans une cellule peut être transmise aux autres cellules. C’est ainsi que la bactérie peut être l'objet de variations génétiques autres que la mutation, par des processus aussi différents que la transformation, la transduction et la conjugaison.

Ces transferts d'acide  désoxyribonucléique (ADN)  bactérien doivent être suivis de recombinaison génétique (qui provient d'une même espèce mais occasionnellement le transfert vers d’autres espèces peut avoir lieu). Dans d'autres circonstances,  l'ADN peut ne pas se recombiner (plasmide).  Ces  transferts de gènes chez les bactéries sont unidirectionnels, le plus souvent partiels  (1 à 2 % du génome transféré) et d'efficacité faible (fréquence de recombinaison de l'ordre de 10^-6). Le donneur cède généralement une petite partie de son ADN au receveur. Ainsi, on n’obtiendra pas  des zygotes complets mais plutôt des zygotes partiels ou mérozygotes.

4-1. Transformation

Par Définition, la transformation "naturelle" ou physiologique est le premier modèle connu de transfert de matériel génétique, qui est fixé et absorbé par des bactéries réceptrices, dites en état de compétence. Ce modèle a permis de démontrer que l'ADN était le support chimique de l'hérédité en 1944. 

4-1-1- Découverte de la transformation.

 En 1928, Frederick Griffith démontre que l'inoculation sous-cutanée à la souris d'un mélange de pneumocoques capsulés (virulents) tués par la chaleur et de pneumocoques acapsulés (non virulents) vivants, entraîne une septicémie mortelle à  pneumocoques capsulés vivants. Il y a donc eu transformation ou « réversion » des pneumocoques acapsulés (R)en pneumocoques capsulés (S).En 1944, Avery Mac Leod et McCarty démontrent que le« principe transformant » est l'ADN bactérien. Ils réussissent à reproduire in vitro la transformation en présence d'ADN fortement polymérisé.  L'activité transformante est perdue en présence de désoxyribonucléase.

1. Facteurs affectant la transformation 

Le transfert, qui est partiel et limité à quelques espèces bactériennes, entraîne l'acquisition par la bactérie réceptrice de nouveaux caractères génétiques stables et transmissibles.  a. Taille de l’ADN

L’ADN double brin nécessaire  pour la transformation doit faire au moins 5 X 10⁵ daltons.  b. Compétence du receveur

Certaines bactéries sont capables d’absorber de l’ADN naturellement. Cependant, ces bactéries prennent seulement de l’ADN à un moment précis de leur cycle de croissance quand elles produisent une protéine spécifique appelée facteur de compétence. Cet état de compétence qui n'apparaît seulement que chez une fraction de la population bactérienne.

 La transformation naturelle ne peut s'observer chez un nombre limité d'espèces bactériennes à Gram positif (Pneumococcus , Streptococcus et Bacillus) ou à Gram négatif (Neisseria, Branhamella, Acinetobacter, Haemophilus). 

La transformation artificielle est précédée du traitement chimique ou enzymatique de la paroi bactérienne avant sa mise en contact avec l'ADN exp: la compétence d’E.coli peut être induite in vitro par traitement chimique (CaCl2 à 0°C).

2- Développement de l’état de compétence

Chez les bactéries à Gram positif, la bactérie excrète un activateur spécifique d'espèce, qui se fixe à la surface de la bactérie. Il y a ensuite synthèse d'une protéine fixatrice de l'ADN, d'une autolysine et une endonucléase. L'ADN fixé est ensuite partiellement hydrolysé puis converti en un fragment monocaténaire (fig.28 a). Chez les bactéries à Gram négatif, l'état de compétence est aussi en relation avec la synthèse d'un activateur de paroi  qui est excrété par la bactérie à la phase exponentielle de croissance chez H. influenzae, ou à la phase stationnaire comme c’est le cas d’Acinetobacter.

3- Étapes de la transformation Elle se produit selon les phases suivantes :

(i) apparition de l'état de compétence (fig 28 a),  (ii) fixation puis pénétration, (iii) et intégration de l'ADN donneur dans le génome de la bactérie réceptrice par recombinaison homologue (fig. 28 b).  Les bactéries transformables sont capables de fixer des ADN de multiples sources mais ne sont capables de former des recombinaisons génétiques que si la bactérie donatrice et la bactérie réceptrice sont génétiquement très proches. Cette relative spécificité est liée à l’homologie des séquences nucléotidiques endogènes et exogènes.

NB : L'ADN donneur se fixe sur la paroi au niveau de sites récepteurs, dans des conditions strictes de métabolisme cellulaire, de pH, de température et d'osmolarité.

Bien que la transformation ne permette que le transfert d'une petite fraction du génome bactérien (<1 %), soit d'efficacité relative (la fréquence de transfert est de l'ordre de 10^-4 à 10^-6) et soit limitée à quelques espèces bactériennes, elle est d'un grand intérêt théorique et pratique.

 La transformation  a permis de comprendre le mécanisme de la synthèse de la capsule, le contrôle génétique de la résistance aux antibiotiques, l'établissement de cartes génétiques, etc... 

Figure 28 : Transformation bactérienne, (a) fixation de l’ADN nu, (b) intégration du fragment d’ADN après recombinaison homologue.

4-2. La conjugaison

L'expérience de Lederberg et Tatum (1946) est à l'origine de la découverte de la conjugaison. Dans un milieu de culture liquide, ces auteurs ont mélangé deux types de mutants auxotrophes d'E.coli. Après plusieurs heures de contact entre les mutants, Lederberg et Tatum ont isolé des E.coli T⁺ L⁺ M⁺ B⁺ (environ 100 pour 10⁸ E.coli).  et en ont conclu que la recombinaison s'était produite avec une faible fréquence (10^-6) et exigeait en plus le contact entre les deux types de mutants auxotrophes.

4-2-1-Caractères de la conjugaison

a- Spécificité 

Le transfert d'ADN chromosomique par conjugaison ne se produit qu'entre bactéries d'une même espèce (spécificité), et surtout chez les bactéries à Gram négatif telles que les entérobactéries (E.coli, Salmonella... et Pseudomonas aeruginosa).  Alors que le transfert d'ADN plasmidique est plus répandu, et est moins spécifique d'espèce.

b- Différentiation sexuelle 

Le transfert du  facteur sexuel qui est à sens unique,  est le premier plasmide connu. L'information génétique qu'il porte code pour la biosynthèse de pili sexuels, pour son insertion possible dans le chromosome bactérien et pour son transfert de ce dernier vers des bactéries réceptrices (F^-).

c- Contact ou appariement 

Le transfert chromosomique n'est possible qu'après appariement par un couple de bactéries donatrice et réceptrice. Il fait d'abord intervenir les pili sexuels (2 à 3 par bactérie F⁺) qui reconnaissent par leurs extrémités les récepteurs à la surface des bactéries F^- et s'y fixent puis se rétractent en rapprochant les deux bactéries.  Ils permettent ainsi leur contact et la formation d'un pont cytoplasmique de 100 à 300 μm par lequel va s'opérer le transfert chromosomique.

d- Transfert de l'ADN 

Le transfert du brin d'ADN dure alors une centaine de minutes à 37°C. Son interruption artificielle par agitation mécanique permet de déterminer la séquence des gènes transférés et d'établir la carte chromosomique.

e- Caractères chromosomiques transférés 

Tous les caractères codés par le chromosome peuvent être transférés. En effet, le facteur F peut être intégré dans le chromosome bactérien à certains sites. Dans cette position il permet le transfert de gènes chromosomiques proches de ces sites d'une bactérie à une autre mais ne transfère que rarement le facteur lui-même (fig. 29).

Le facteur F peut rester autonome dans le cytoplasme. Dans cette position il ne transmet à la bactérie réceptrice que le facteur F mais pas de gène chromosomique. Lors du passage de l'état intégré à l'état autonome, le facteur F peut emporter avec lui des gènes bactériens. Le résultat en est un plasmide F' qui contient ces gènes et capable de les transférer à une bactérie réceptrice de nouveaux gènes : c'est la F-duction ou sex-duction. 

Si les gènes transférés par le facteur F' s'intègrent dans le chromosome de la bactérie réceptrice, on dit qu'il y a eu recombinaison légitime (chromosomique). S'ils ne s'intègrent pas, ils deviennent de véritables gènes mobiles d'une bactérie à une autre.

f- Plasmides conjugatifs 

Certains plasmides sont capables d'assurer tous seuls leur transfert par conjugaison. On les appelle alors plasmides conjugatifs.

4-2-2- Conjugaison F⁺x F^-

La conjugaison est un transfert d'ADN entre une bactérie donatrice et une bactérie réceptrice,  qui nécessite le contact et l'appariement entre les bactéries, et repose sur la présence dans la bactérie donatrice ou mâle d'un facteur de sexualité ou de fertilité (facteur F).  Celui-ci permet la synthèse de pili sexuels et donne la polarité au chromosome. Le facteur F réside habituellement sur un plasmide. Les souches donneuses sont appelées F⁺  tandis que les souches dépourvues sont appelées F^-. Le pont cytoplasmique formé, le transfert génétique peut commencer.  Il ne porte d'abord que sur un brin d'ADN, ce qui permet de restaurer l'intégrité du génome de la bactérie donatrice par un processus de réplication asymétrique. Ce processus de réplication asymétrique a lieu tout près du pont cytoplasmique et met en jeu un site de réplication spécifique (fig. 29). 

4-2-2-1 Modèle de réplication du plasmide : Une queue simple brin est générée par une endonucléase au niveau du site ori T, l’extrémité 5’ migre vers la cellule réceptrice, et peut être converti en la forme double brin par la synthèse d'un brin complémentaire (fig. 30).  Alors que le DNA du coté 3’ sera répliqué par complémentarité de manière continue,  l’extrémité 5’ est  répliquée de manière discontinue par les Fragments  d’Okazaki.

Ce modèle du cercle roulant (fig. 30) s’applique aussi pour la réplication des bactériophages à ADN, qui donnera d’ abord naissance à un long concatémaire qui sera ensuite clivé en unités phagiques. 

Figure 29 : Conjugaison F⁺x F^- (à droite) et Hfr x F^- (à gauche).

Figure 30 : Modèle de réplication des plasmides dit « du cercle roulant ».

4-2-3- Conjugaison Hfr x F^-

Une souche Hfr (Haute fréquence de recombinaison) résulte de l’intégration du  facteur F dans le chromosome. L’insertion du facteur F se fait  par crossing-over (fig. 29). La recombinaison se fait entre deux sites IS (RSS).  

La conjugaison Hfr x F^- est un transfert d'ADN chromosomique qui est à sens unique, orienté,  progressif et quelquefois total (fig. 29), a beaucoup de similitudes avec le transfert d'ADN extra chromosomique (plasmidique). La cellule bactérienne ‘femelle’ qui vient de se conjuguer avec une cellule bactérienne ‘mâle’ et qui contient un fragment d’ADN mâle (après recombinaison) est dite exconjugant. 

4-2-3-1-La conjugaison Hfr x F^- permet de déterminer la liaison génétique et d’établir les cartes génétiques 

La conjugaison interrompue permet de déterminer quels gènes sont transmis de Hfr à F- et dans quel ordre. En effet, chaque allèle du donneur apparaît chez le receveur à un instant précis après le début du croisement (fig. 31). De plus, les allèles du donneur apparaissent dans un ordre déterminé à partir d’un point appelé origine (O).

Le transfert de gènes linéaire est arrêté par rupture du pont de conjugaison pour étudier l’ordre d'entrée dans la cellule receveuse (fig. 31A). L’orientation dans laquelle F s’insère détermine la polarité du transfert du chromosome Hfr.  À une extrémité du facteur F intégré se trouve l’origine (fig. 31B). Le terminus du transfert, proche de l’autre extrémité de F, n’est transféré qu’après que  tout le chromosome l’ait été. 

4-2-4- Conjugaison F’X F^-. 

Lorsque F s’insère entre les gènes ton et lac dans une séquence répétitive IS1, il donne  une souche Hfr. L’excision anormale de F, par recombinaison avec un autre  élément IS2, inclue le locus lac. La résultante est le F’ lac. Lorsque ce dernier est transmis dans une autre cellule (réceptrice) par conjugaison F’x F^-, il en résulte un  diploide partiel F’lac+ / lac-. 

NB : Le plasmide F ne possède pas un seul site d’insertion, il peut recombiner avec plusieurs IS.

Figure 31 : (A) Transfert des gènes par conjugaison Interrompue Hfr x F^-,  (B) insertion du plasmide dans le chromosome bactérien par RSS entre deux IS1. 4-3- Transduction

Un  phage se compose d’un «chromosome» d’acide nucléique (ADN ou ARN), entouré d’une paroi de protéines: capside.  Le tout forme une nucléocapside.

Figure 32 : Structure du phage T4 d’E. coli.

La plupart des bactéries sont sensibles à l’attaque par des bactériophages. Ces derniers sont utilisés dans la lysotypie, et on rencontre deux types :

Les Phages virulents : suivent un cycle lytique. 

Les Phages tempérés: suivent un cycle de lysogénie, restent intégrés dans l’ADN bactérien sous forme de prophage (ne détruisent pas leurs gites et leurs couverts). 

4-3-1- Lyse et lysogénie

4-3-1-1- La lyse est la rupture et la mort d’une cellule  bactérienne  à la suite de la libération de  la descendance d’un phage infectant. Les plages de lyse  sont en fait, le résultat de ce cycle lytique. La morphologie de la plage de lyse est un caractère du phage utilisable pour l’analyse génétique. De même, le spectre d’hôtes peut être analysé. Les phages diffèrent entre eux par  le spectre de souches bactériennes qu’ils peuvent infecter et lyser. 

4-3-1-2- Lysogénie Lorsque des bactéries  sont infectées par des phages, une petite fraction de cellules infectées ne se lysent pas, mais deviennent lysogènes. Les bactéries lysogènes contiennent un prophage dont la présence  protège la cellule de l’infection par un autre phage, ou surinfection, et qui est dupliqué et  transmis aux cellules filles lors de la division. Chez une petite fraction des cellules lysogènes, le prophage est induit, ou activé, produisant ainsi des phages infectieux. Les phages peuvent donc être virulents, suivant un cycle infectieux qui est toujours lytique, ou ils peuvent être tempérés, suivant un cycle lysogène au cours duquel  le phage est présent dans la cellule bactérienne sous la forme d’un prophage. 

4-3-2- Recombinaison des phages

 La recombinaison entre les ADN phagiques peut être observée entre  les molécules parentales de deux virus  dans une même cellule hôte, par le biais d’une infection mixte. C’est une recombinaison homologue entre des séquences des deux molécules virales, générant une molécule recombinante

(fig.33).

4-3-3-Phénomènes de Transduction

En 1952, N. ZINDER et J. LEDERBERG tentent d'obtenir des recombinants après croisement de mutants auxotrophes de souches de Salmonella typhimurium (LA22, LA2) responsables de toxiinfections d'origine alimentaire. La fréquence des recombinants histidine+ tryptophane+, de l'ordre de 10^-6, n'est pas modifiée lorsque les souches parentales, séparées par un filtre en verre fritté, ne sont plus en contact (Fig. 34 A). L'existence d'un agent filtrable, vecteur de l'information génétique est démontrée (bactériophage tempéré produit par la souche parentale lysogène, LA 22). 

Certains phages sont  capables de mobiliser  des gènes bactériens  et de les transporter  d’une cellule à une  autre. Ce phénomène est appelé transduction.  Il existe deux types de  transduction: généralisée et  spécialisée. Dans la  transduction générale,  les phages peuvent  transporter n’importe quelle région du chromosome (fig.34 B), alors que dans la transduction spécialisée ou spécifique, les phages transfèrent des parties bien précises du chromosome bactérien. 

Quand il est excisé normalement (fig. 35 B), le nouveau phage est complet et ne contient pas de gènes bactériens. Rarement l’excision se produit de manière asymétrique (Fig. 35 B), et les gènes gal sont assimilés et certains gènes phagiques sont perdus.  Le résultat est un phage lambda défectueux qui porte des gènes bactériens et peuvent être transférer à une autre cellule. 

Figure 35 : Transduction spécialisée, A : Insertion de l’ADN du phage, B : Excision de l’ADN du phage et transduction spécialisée.

4-3-3-1- Transduction et virulence

Lorsque les gènes transférés par transduction spécialisée codent des facteurs de virulence, la bactérie réceptrice voit son pouvoir pathogène augmentée.

Conversion lysogénique :

On a noté une interdépendance totale entre les caractères lysogène et toxinogène chez quelques bactéries suite à une conversion lysogénique, où la perte du prophage s’ensuit par une perte de virulence (la bactérie perd la capacité à produire la toxine).

*exemple les gènes stx(Shigella like toxines) d’Escerichi coli entérohémorragique (EHEC). Ces gènes sont localisés dans de séquences des bactériophages lambda, ces souches entérohémorragiques auraient émergées par conversion lysogénique.

*toxine de Vibrio cholerae portée par le phage CTX, 

*Toxine érythrogène de Streptococcus pyogenes responsable de la scarlatine.

4-3-3-2- Transduction in situ

Le transfert d’îlot de pathogénie (SaPis) par un bactériophage (qui ne forme pas de plages de lyse) : comportant la toxic shock toxine entre Staphylococcus aureus et Listeria monocytogenes dans le lait cru (Chen et Novick, 2009).

4-4- Cartographie 

Dans une conjugaison interrompue (des suspensions contenant des concentrations similaires du donneur et du receveur, sont réparties dans 100 tubes à essai), expérimenter le pont cytoplasmique est cassé (rompu) : est arrêté à divers intervalles de temps après le début de la conjugaison par le mélange de la culture vigoureusement (à chaque intervalle deux ou trois tubes sont répliqués sur milieux spécifiques pour analyse). Pour qu’un exconjugant puisse acquérir les gènes du donneur  le fragment d’ADN  doit se recombiner avec le chromosome du receveur. L’ordre et le temps de transfert des gènes peuvent être déterminés parce qu'ils sont le reflet direct de l'ordre des gènes sur le chromosome bactérien. La carte globale est ajustée  en 100 minutes, bien que le transfert complet puisse exiger plus de 100 minutes. En un sens, les minutes sont une indication de distance sur la carte et non pas strictement une mesure du temps. D’ailleurs le temps zéro est fixé à l’entrée du locus de la thréonine (Thr).

4-5- Nouveaux transferts génétiques horizontaux chez les bactéries 

Les GTA (gene transfer agent) ont été mis en évidence pour la première fois chez Rhodobacter capsulatus, répandu chez les alphas protéobactéries dans les milieux marins. Plus petits que des phages, ces particules virales qui ont sans doute perdu leurs capacité de propagation : ni infection, ni lyse possèdent des gènes homologues aux gènes viraux, et  une structure similaire. Les ADN transférés peuvent varier de 4.1 à 14 Kpb. Ces GTA semblent fonctionner uniquement pour la médiation de l'échange de gènes (Lang et Beatty, 2007).