2. DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE DES INFECTIONS VIRALES

2.1. Les deux approches diagnostiques des infections virales

Le diagnostic virologique repose, comme le diagnostic bactériologique, sur 2 approches:

* le diagnostic direct, décelant dans les produits biologiques la présence du virus ou de ses composants, antigènes ou génomes viraux ;

* le diagnostic indirect, décelant l'apparition dans le sang d’une réponse immunitaire sous forme d'anticorps spécifiques du virus. Ces deux approches ne s'excluent pas et sont parfois complémentaires.

Indiquons d'emblée que recherche d'antigènes et recherche d'anticorps utilisent des réactions antigène-anticorps au mécanisme identique, la différence venant de l'origine des composants de la réaction. Dans le diagnostic direct, on recherche, à l’aide d’anticorps de référence (souvent monoclonaux) contenus dans la trousse de réactifs, la présence éventuelle dans les produits biologiques d'antigènes viraux correspondants. En revanche, dans le diagnostic indirect, on recherche, à l’aide d’antigènes viraux de référence contenus dans la trousse de réactifs, la présence éventuelle dans le sang d'anticorps antiviraux correspondants.

2.2. Diagnostic direct

Diverses techniques sont utilisables.

2.2.1. Microscopie électronique

Elle recherche des particules virales ; elles ne sont décelables qu’en concentration suffisante dans les prélèvements examinés (10⁶ par mL), seuil rarement atteint en dehors des diarrhées virales ou des liquides de vésicules. Ce défaut de sensibilité, ajouté à la lourdeur de la technique, fait que la microscopie électronique ne peut pas être considérée comme une approche diagnostique.

2.2.2. Isolement viral

C’est une technique classique au cours de laquelle les virus présents dans un échantillon se multiplient dans une culture cellulaire in vitro, réalisée avec des cellules dites « permissives » (capables de subir un cycle replicatif complet du virus en question), à l’instar des cultures bactériennes en bouillon ou sur gélose. La multiplication virale qui suppose plusieurs cycles de réplication demande quelques jours, voire quelques semaines. Tous les virus ne se multiplient pas en culture de cellules in vitro et il n’existe pas un type de culture polyvalent, de sorte que pour

ratisser au plus large, le laboratoire doit recourir à plusieurs types de cultures cellulaires.

Dans les cas les plus évidents, la multiplication virale se traduit par un effet cytopathique (ECP).C'est le témoin, visible en microscopie optique, de la multiplication lytique du virus. Les cellules dans les cultures in vitro (qui sur le support de verre ou de plastique, apparaissent normalement plates, confluentes, peu réfringentes) s'arrondissent, deviennent réfringentes et se détachent du support dans le milieu de culture ; certains virus induisent l'apparition de syncytiums par fusion de

la membrane cytoplasmique de cellules voisines, de proche en proche. Cet aspect de l'ECP peut donc être plus ou moins évocateur d'un virus ou d'une famille virale.

L’isolement en culture de cellules in vitro est fastidieux, mais il garde l’avantage de produire des virus infectants, utiles pour certaines caractérisations ultérieures comme la capacité de multiplication ou la détermination de la concentration inhibitrice d’un antiviral (antivirogramme).Lorsque l'ECP est tardif ou lorsqu'il est absent, on peut être conduit à rechercher dans des cultures apparemment normales un antigène viral ou des génomes viraux (ou plus rarement une activité enzymatique spécifique comme une activité transcriptase inverse par exemple) (fig. 2). Cette approche est notamment utilisée dans le cadre des cultures rapides, où l’on recherche un antigène viral précoce après 24h d’inoculation d’un prélèvement sur une culture cellulaire.

2.2.3. Détection rapide d’antigène viral directement dans les produits biologiques

Ce diagnostic direct pratiqué à l'aide d'anticorps souvent monoclonaux est très largement utilisé car c'est une technique rapide, évitant les aléas de la culture cellulaire in vitro, pouvant de surcroît s’appliquer à des virus impossibles à cultiver.

* L’immunocytodiagnostic sur un prélèvement cellulaire (sécrétions muqueuses, frottis de lésion, sang ou biopsie) consiste en la recherche de matériel viral dans le cytoplasme ou le noyau en immunofluorescence ou immunoperoxydase. Les anticorps antiviraux sont directement marqués ou reconnus par un deuxième anticorps conjugué à un fluorochrome ou à une enzyme catalysant une réaction colorée (fig. 3). Les applications les plus fréquentes de ce type de diagnostic sont la recherche d’antigènes de virus respiratoires dans les sécrétions nasopharyngées et la recherche d’antigène du CMV dans les polynucléaires (antigénémie CMV).

* La détection d'antigènes solubles (indépendants de tout support cellulaire) dans les produits pathologiques liquides ou extraits liquides, s‟effectue selon plusieurs techniques :

- technique ELISA où la réaction antigène-anticorps implique une adsorption de

réactifs sur le fond d'un puits en plastique, puis une réaction enzymatique colorée

dans le liquide du puits (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) ;

- immunodiffusion sur bandelette de papier ou immunofiltration ("savonnette") ;

- test au latex où une suspension de particules de latex enrobées d'anticorps antiviraux

est mélangée à un extrait liquide de produits biologiques ; les particules de latex vont

se trouver agglutinées par l'intermédiaire de l'antigène viral correspondant, et à l’oeil

nu, la suspension de particules de latex, d'homogène va devenir granuleuse.

Les applications les plus fréquentes de ce type de diagnostic sont la recherche dans le sang des Ag HBs du HBV et p24 du HIV, ou la recherche d’antigènes de rotavirus dans les selles.