Techniques d’analyses
biologiques
Faculté des sciences de la Nature et Vie
Chapitre 3
Méthodes physiques d’analyses
la chromatographie en phase liquide à haute
performance HPLC
Partie 2
Méthodes Chromatographiques
D’adsorption
Chromatographie sur Couche mince CCM
Chromatographie Phase gaz CPG
Historique
La chromatographie est une science très ancienne.
Quelques noms et dates :
- 1903 : mise en évidence par Mikhail TSWETT, botaniste russe
- 1931 (KUHN et LEDERER) : chromatographie sur colonne (chromatographie
liquide-solide CLS)
-1938 (IZMAILOV et SCRAIBER) : chromatographie sur couche mince (CCM ou
TLC ;Thin layer chromatography),
TAYLOR et UREY : chromatographie par échange d’ions
- 1941 (MARTIN et SYNGE, Nobel en 1952) : concept de chromatographie gaz-
liquide, chromatographie de partage liquide-liquide
- 1952 : développement pratique de la chromatographie gaz-liquide
- 1955 : 1ièr chromatographe gaz-liquide sur le marché (chromatographie en
phase gazeuse : CPG ou GC)
- 1965 (HALASZ, HORVATH) : Chromatographie Liquide Haute Performance
(CLHP ou HPLC)
Introduction
Définition
La chromatographie est une technique physique de séparation d'espèces chimiques
qui permet l’identification et le dosage des différents composés d’un mélange.
Principe
Chromatographie est basée sur les différentes affinités d’un ou plusieurs composés Ã
l’égard de deux phases (stationnaire et mobile).
L'échantillon est entraîné par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a
tendance à retenir plus ou moins les composés de l'échantillon à l'aide de différentes
interactions.
L’échantillon est adsorbé puis désorbé sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins
soluble dans la phase mobile.
Introduction
Classification des méthodes chromatographiques :
On distingue les différentes méthodes chromatographiques classées de plusieurs
manières différentes :
1- selon la nature des phases (mobile et stationnaire).
Phase stationnaire :
- sur une surface plane : chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC)
- dans une colonne au travers de laquelle progresse la phase mobile par gravité ou
sous l’action d’une différence de pression : chromatographie sur colonne
Phase mobile :
phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, Entraînant avec
elle l’analyte.
Le processus d’entraînement de cet analyte est appelé élution.
La phase mobile peut être un liquide ou un gaz.
Introduction
On peut nommer les types de chromatographies selon les interactions
développées par la phase stationnaire :
•la chromatographie d'adsorption/d'affinité
•la chromatographie de partage
•la chromatographie à échange d'ions
•la chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL)
•la chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais)
Introduction
on peut notamment les classer selon la nature de la phase mobile :
•la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais)
•la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais)
également appelée CPV(chromatographie en phase vapeur)
•la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais)
•la chromatographie en phase liquide à haute performance
(CLHP ou HPLC en anglais)
•la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais).
Classement des types de chromatographie selon la nature des phases
Résumé des types de chromatographies
Introduction
Remarque:
Il est rare de pouvoir associer une méthode chromatographique à un seul
phénomène.
Introduction
Utilité de la chromatographie
Selon la quantité de produit appliqué en chromatographie, on s’en sert pour:
• Analyser < 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV
• Séparer ou purifier les produits d’une réaction par chromatographie éclair
ou HPLC (50 mg à 15 g)
• Doser des produits. L’analyse quantitative se fait avec un étalon interne ou
après préparation d’une courbe de calibration.
Chromatographie
sur Couche mince
CCM
Chromatographie d’adsorption:
principe
La chromatographie d’adsorption est basée sur le partage des solutés entre
l’adsorbant solide fixe(stationnaire) et la phase mobile.
Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une
Force d’entraînement par la phase mobile.
L’équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de
l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation.
Les séparation sont basées sur le principe de polarité, c’est-à -dire l’existence de
dipôles dans une structure moléculaire.
Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire):
Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine,
charbon activé.
CCM
CCM
Adsorbants
Les adsorbants sont sous forme de granules calibrés.
La séparation est meilleure, mais plus lente si les grains sont fins.
Plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les composés polaires.
La séparation se fait par ordre croissant de leurs forces d’interaction avec les
composés polaires.
Polarité des groupements fonctionnels neutres
Le gel de silice est polaire, il a par conséquence une plus grande affinité
pour les composés polaires:
Un composé peu polaire est peu adsorbé.
Un composé polaire est très adsorbé.
Remarque:
Les molécules chargées ne migreront habituellement pas sur gel de silice,
elles sont trop polaires.
CCM
Phase mobile
Une phase mobile liquide est appelée éluant.
C’est elle qui fait migrer les composés,
son choix est donc important.
Il faut que le soluté soit soluble dans l’éluant.
Il est possible de faire des mélanges de solvants
pour changer sa polarité.
Choix de l’éluant
Deux facteurs interviennent lors de l’interaction entre l’éluant et le soluté
(mélange de composés à séparer):
• la solubilité:
on doit être en mesure de dissoudre le soluté dans l’éluant pour que la
migration se fasse.
• la polarité:
La polarité de l’éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre.
Moins un composé est polaire, moins il s’accroche à l’adsorbant, plus il
migre avec l’éluant. Choix d’un éluant peu polaire
Plus un composé est polaire, plus il s’accroche à l’adsorbant, moins il
migre avec l’éluant. Choix d’un éluant polaire
CCM
CCM
Chromatographie sur couche mince
L’adsorbant (silice, 250 µm d’épaisseur) est fixé sur une plaque (Al, verre)
commercialement disponible.
Le produit/mélange de produits est déposé sur la plaque à l’aide d’un
capillaire.
Les produits sont révélés après élution.
Préparation d’un capillaire
Au laboratoire, les capillaires sont préparés au départ de pipettes Pasteur:
• Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme en tournant le tube
jusqu’à ce qu’il soit mou.
• Retirer de la flamme et étirer la pipette.
• Laisser refroidir et couper la partie fine du milieu.
CCM
Remarque:
Généralement les capillaires sont disponible comme matériel du laboratoire
Utilité des CCM
Révélation de la CCM
Élution de la CCM
Mesure du Rf
Influence de l’éluant
Le développement bidirectionnel (ou chromatographie CCM bidimensionnelle)
utilise deux solvants différents et deux directions de migration perpendiculaires
pour séparer des mélanges complexes․Après le développement, la plaque est
retirée de la cuve et le front du solvant est rapidement marqué․
CCM bidirectionnelles
Chromatographie Phase gaz
CPG
Chromatographies en phase gazeuse (CPG)
La phase mobile est un gaz appelé gaz vecteur ou encore gaz porteur.
On distingue dans ce cas :
La chromatographie gaz-liquide : C’est une chromatographie de partage.
La phase stationnaire est un liquide fixé par imbibition d’un support inerte.
La chromatographie gaz-solide : C’est une chromatographie d’adsorption.
La phase stationnaire est un solide adsorbant.
CPG
Principe :
La CPG est appliquée pour les substances volatiles.
Le mélange à éluer (séparer) est injecté à l’aide d’une seringue.
Une fois vaporisés par l’injecteur, les composés sont entraînés dans la colonne
par le gaz vecteur inerte(le plus souvent He ou N2).
Suivant l’affinité avec la phase stationnaire, les composés sont séparés avant
d’être détectés en sortie de colonne. Les appareils de CPG sont fréquemment
couplés avec un spectromètre de masse pour l'identification des composés au fur
et à mesure de le leur élution(séparation).
Schéma de principe
Exemple d’un appareil CPG
Appareillage de CPG : Il est constitué de 3 parties
•un injecteur
•une colonne placée dans une enceinte thermostatée
•un détecteur
L’échantillon est vaporisé et injecté au sommet de la colonne. L’élution est
assurée par un flux de gaz inerte appelé gaz vecteur (phase mobile). Il n’y a pas
d’interaction entre l’analyte et la phase mobile en CPG.
la chromatographie en phase liquide à haute
performance HPLC
Définition
C'est ce que l'on a appeler la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC).
Très rapidement le P de pression est devenu le P de performance lorsque l'on a
optimisé la technique:
- diminution de la taille de particules de la phase stationnaire
- Contrôle de pression
HPLC
Introduction
La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui
n'étaient auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ou
en phase gazeuse.
A l'origine la chromatographie en phase liquide se faisait sur des colonnes en verre.
Le liquide traversait la phase stationnaire par gravité ou sous faible pression.
Puis pour augmenter le débit, des manipulations ont été réalisées sous pression
plus forte.
HPLC
Principe
- Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant.
- Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant).
Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase
stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique.
- La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt
le système chromatographique.
- Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système
chromatographique.
Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité
entre la phase mobile et la phase stationnaire.
- En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés
sont caractérisés par un pic.
- L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme
HPLC
Chromatogramme
Principe
temps rétention (tr): temps mis par
soluté pour traverser colonne
temps rétention réduit (tr’):
temps passé par soluté dans phase
stationnaire
Plus les grains sont petits, plus la
surface de contact entre les deux
phases est élevée
Plus de contact = meilleure séparation
Principe
HPLC
Chaque substance détectée sera
matérialisée par un pic
(même chose que CPG)
HPLC Exemple d’appareil HPLC
Quelques modèles de colonne
