Techniques d’analyses
biologiques
Faculté des sciences de la Nature et Vie
Chapitre 3
Méthodes physiques d’analyses
Partie 3
Polarimétrie
Réfractométrie
Historique
La Polarimétrie une méthode qui a était découverte par BIOT en 1812 sur des
cristaux puis en 1815 sur des molécules organiques. Cette méthode n'est
applicable qu'aux molécules optiquement actives (chirales).
Molécule chirale:
- (chiral du grec Main) une molécule chirale est non superposable à son
image dans un miroir au moins un carbone asymétrique.
- Un objet ou une molécule asymétrique ne possède aucun élément de
symétrie:
Ni centre de symétrie
Ni axe de symétrie
Plan de symétrie
- Cette asymétrie est à l'origine de l'activité optique des molécules
chirales.
Introduction
Substance optiquement active:
-C’est une substance chirale ou molécules organiques avec au moins un
carbone asymétrique*, qui interagissent avec une OEM (Onde électromagnétique).le résultat
est une rotation du plan de la lumière polarisée d’un angle appelé pouvoir rotatoire.
carbone asymétrique: noté C* est un carbone hybridé SP3donc
quatre (4) liaisons simple (sigma σ) c'est-à-dire lié à quatre
atomes ou groupes d'atomes différents (qui possède quatre
substituant de nature différente.
Exemples:
L’Activité optique
La lumière est une Onde Electromagnétique (OEM) elle est due a la propagation
d’un champs électrique E et magnétique B.
Les ondes électromagnétiques sont transversales :
le vecteur du champ électrique Eet le vecteur du champ magnétique Bsont
perpendiculaires l’un à l’autre et situés dans un plan normal à la direction de
propagation k.
OEM (Onde électromagnétique)
Polarisation de la lumière
La polarisation de la lumière,c’est le changement de direction (orientation) du
champ E, la direction du champ E indique la direction de polarisation.
Lumière naturelle: polarisée aléatoirement (temps, position …).
Lumière polarisée: Quand la lumière traverse un polariseur,le champ électrique ne
peut plus vibrer que dans une direction perpendiculaire àla direction de
propagation k.La lumière est polarisée rectilignement.
Mécanismes de l’activité optique
Lorsqu’un rayon de lumière linéairement polarisé traverse une substance dite
optiquement active, il conserve sa polarisation mais son plan de polarisation subit
une rotation d’angle αautour de la direction de propagation.
Lorsque une lumière polarisée traverse une solution optiquement active
(solution renfermant des molécules chirales).
Il existe deux variétés de substances optiquement actives :
a. Les substances lévogyres: qui font dévier le plan d’une lumière polarisée dans
le sens horaire (sens des aiguilles de la montre) vis-à-vis d’un observateur avec angle
Alpha α.
On attribue a leur pouvoir rotatoire un signe (-) noté (
l
).
b. Les substances dextrogyres: qui font tourner le plan d’une lumière polarisée
dans le sens antihoraire (sens inverse des aiguilles de la montre) vis-à-vis d’un
Observateur avec angle Alpha α.
. On attribue a leur pouvoir rotatoire un signe (+) noté (
d)
.
Interaction entre lumière polarisée et substance active
L'appareil qui permet de mesurer les rotations optiques est le polarimètre. Il existe :
Polarimètre manuel. il existe plusieurs sortes de polarimètres.
Il y a le célèbre polarimètre de Laurent, et d'autres construit sur le même principe
Par exemple (polarimètre de Lippich, de Zeiss).
Polarimètre
Principe de fonctionnement de polarimètre
La source lumineuse la plus fréquemment employée est une lampe au sodium
qui donne une lumière monochromatique (λ = 589,3 nm).
La lumière est d' abord polarisée grâce à un prisme de Nicol (prisme polariseur),
formé de deux prismes de cristal de calcite.
Elle trouve ensuite une cellule (tube polarimètrique) contenant l’échantillon (Il ne
doit pas rester de bulle d'air sur la fenêtre et on doit pouvoir lire en regardant à
travers le tube. Cela implique que les disques de verre soient propres et secs au
départ et que la solution soit limpide et homogène).
La rotation du plan est détectée par un autre prisme de Nicol ; le prisme analyseur
qui peut être tourné manuellement.
La différence mesurée en degrés est la rotation optique observée α(alpha) de
l'échantillon.
Lecture : dans le polarimètre, on utilise une lame demi onde sur l'oculaire dont
le but est d'obtenir deux champs de pénombre.
La valeur de l'angle de rotation du plan de polarisation peut être mesuré une fois
que l'on est en zone d'équipénombre.
Les caractéristiques essentielles d’un polarimère sont les suivantes
Loi de Biot
On applique la loi de Biot qui dit que l'angle de rotation est proportionnel à
la longueur de cuve et à la concentration.
La constante de proportionnalité est appelée pouvoir rotatoire de la substance
(pouvoir rotatoire spécifique).
Elle dépend de la température et de la longueur d'onde à laquelle l'expérience a
été réalisée. On peut donc écrire la loi de Biot sous la forme :
α= [α]T,λ. l .C
Où :
α: angle de rotation du plan de polarisation observé en (degrés °)
l: longueur de la cuve en cm.
C: concentration de la solution en g / ml.Ou Kg/l
[α]T,λ: pouvoir rotatoire spécifique défini à une température Ten °C et mesuré pour
une longueur d'onde λdonnée , on utilise la raie Ddu sodium (Na) λ=5893 A°
l’angle de rotation du
polariseur/analyseur est de + (43,5 + 0,3)°. L’angle est de (signe +)
(cas d’une substance déxtrogyre)car les valeurs d’angles sur la partie
mobile vont de 40° en haut à 50° en bas. On lit ensuite les 43,5° sur la
partie mobile : le 0 de la partie fixe est juste après la graduation des
43,5°. Puis on trouve les 0,3° sur la partie fixe (correspondance
entre traits des parties fixe/mobile).
Si on tourne l’analyseur vers la gauche (cas d’une substance
lévogyre),les valeurs croissantes des angles lus sur la partie mobile
vont vers le haut (signe -). On peut utiliser la partie haute du vernier
pour faire la lecture des dixièmes de degré (à 0,5 dixième près).
Dans l’exemple ci contre, l’angle de rotation du polariseur/analyseur
est de - (16,0 + 0,1)°. L’angle est - car les valeurs d’angles sur la
partie mobile vont de 10° en bas à 20° en haut.
On lit ensuite les 16,0 sur la partie mobile: le 0 de la partie fixe est juste
après la graduation des 16,0°. Puis on trouve les 0,1° sur la partie fixe
(correspondance entre traits des parties fixe/mobile).
1. Pour améliorer la précision sur la détermination de la valeur expérimentale du pouvoir
rotatoire [α], relever les mesures de α pour les concentrations suivantes par dilution : C, 3/4 C,
C/2, 2/3 C, C/3, C/4. (faire au moins 3 solutions sur les 5 proposées)
2. Tracer la courbe α = f(C) (qui passe par l'origine) et en déduire le pouvoir rotatoire
[α] en valeur et en signe (tracer autour de chaque point le rectangle d'erreur). On
pourra également déterminer [α] par régression linéaire.
Mesure du pouvoir rotatoire [α] pour différentes concentrations
Polarimètre numérique
Les polarimètres numériques et automatiques fonctionnent rapidement avec une haute
résolution et une plus grande précision que les polarimètres classiques. Ils sont simples à utiliser
et efficace du point de vue du temps passé.
Réfractométrie
On appelle réfraction le changement de direction que subit un rayon lumineux en
passant d'un milieu optique donné à un autre.
Ce changement est dû à une modification de la vitesse de propagation à partir
du point, appelé point d'incidence, où le rayon lumineux incident frappe
l'interface.
La réfractométrie permet la mesure de l'indice de réfraction d'un milieu
Définition
On appelle dioptre l'interface entre deux milieux d'indices optiques différents.
L'indice de réfraction n d'un milieu caractérise la vitesse de propagation de la lumière
dans ce milieu.
Plus précisément, pour une onde monochromatique, de longueur d'onde λ à
température et pression fixées l'indice nd'un milieu est défini par le rapport entre
la vitesse de la lumière dans le vide, notée c et celle mesurée dans ce milieu, notée v :
L’indice décroît avec un accroissement de la température ou lorsque la longueur d'onde
augmente. La pression est rarement mentionnée car elle a une influence moins importante
que la température sur l'indice de réfraction des liquides.
L'indice de réfraction
Quelques valeurs d'indice de réfraction de liquide et solide à la longueur de
référence de 589 nm et à la température de 20°C.
Exemples d’indice de réfraction
Le terme de réfractomètre est principalement utilisé pour nommer des appareils qui
permettent de déterminer l'indice de réfraction d'un liquide, bien qu'il existe également
des instruments qui permettent la détermination de l'indice de réfraction d'un solide.
Description d'un réfractomètre
L’appareil se compose:
•D'un prisme mobile d'éclairage P' plus une lampe de Na.
•D'un prisme réfractomètrique P fixe sur lequel on dépose une goutte du liquide dont on veut
déterminer l'indice de réfraction n.
•De deux oculaires O et O', celui du bas (O) permet de pointer la ligne de séparation des deux
zones claire et obscure, celui du haut (O') permet la lecture de l'échelle des indices.
Ces deux oculaires sont munis de système de lentilles dont le réglage permet une vision
nette pour chaque utilisateur.
•D'un dispositif permettant l'éclairage de l'échelle des indices.
•D'un bouton M permettant d'amener la limite de séparation dans le réticule de l'oculaire O.
Il se situe à droite du réfractomètre lorsqu'on place l’oeil dans l'un des oculaires ;
•D'un bouton M' faisant tourner le système compensateur, série de prismes compensateurs,
permettant de déterminer l'indice de réfraction équivalent à la raie u sodium et de supprimer
les colorations que peut présenter la limite de séparation entre la plage sombre et la plage
claire. Ce bouton M' se situe à gauche du réfractomètre lorsqu'on place son oeil dans l'un des
oculaires.
•D'un thermomètre pour repérer la température lors de la mesure de l'indice de réfraction ;
•D'un système de régulation de la température.
Description d'un réfractomètre
Diriger les prismes vers une source lumineuse ;
Mettre en marche le système de régulation de température ;
Soulever le prisme mobile et déposer une ou deux gouttes de liquide sur la surface du
prisme fixe ;
Rabattre doucement le prisme mobile ;
Observer au travers de l’oculaire et utiliser une première molette (M) pour obtenir un bon
contraste entre une zone claire correspondant aux rayons réfractés et une zone sombre
correspondant à l’absence de rayons réfractés.
Ensuite avec la deuxième molette (M’), amener la limite de séparation au centre du
réticule.
Mesure expérimentale sur un réfractomètre
•Ne pas toucher les parties optiques avec les doigts ;
•Ne pas rayer les prismes : le liquide est déposé délicatement avec une pipette
pasteur et les prismes nettoyés avec du coton, du tissu doux ou du papier
fin imbibés d’éthanol.
•L’échantillon ne doit pas contenir de particules solides.
Précautions pondant les mesures
