Techniques d’analyses
biologiques
Faculté des sciences de la Nature et Vie
Chapitre 3
Méthodes physiques d’analyses
Partie 4
Électrophorèse
Définition
L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers
d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.
Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge
nette z, à une vitesse v proportionnelle à cette charge.
Objectives de l’électrophorèse:
Cette technique permet, entre autre, de :
•déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer
leur masse molaire respective
•d'évaluer le degré de purification d'une protéine
•de séparer des protéines
Introduction
Applications principales : biochimie et biologie moléculaire. Séparation
des protéines et des acides nucléiques
Le principe repose sur la migration de molécules chargées (perte de neutralité
électrique) dissoutes ou en suspension dans un solvant, sous l’effet d’un champ
électrique
-Champ électrique : générateur de courant continu
-Support du champ : tampon conduisant le courant d’un pôle à l’autre
en fonction des caractéristiques propres des molécules et des conditions
d’électrophorèse la vitesse de migration est différente pour les molécules
chargées et permet leur séparation les unes des autres.
Cation : chargé +. Attiré lors de l’électrolyse par la cathode (ou électrode
négative)
Anion : chargé -. Attiré lors de l’électrolyse par l’anode (ou électrode positive)
Principe :
Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l’électrophorèse,
la vitesse de migration et la distance parcourue dans la matrice par ces
ions diffèrent, ce qui permet leur séparation.
Principe :
Principe de la migration
La migration dépend de plusieurs facteurs :
•Mobilité électrophorétique µ
La mobilité électrique c’est la vitesse de déplacement des particules dans la suspension,
et elle dépend de la charge, de la taille et de la géométrie (dimension) de la particule.
•La charge Q
La charge dépend du pH isoélectrique de la particule et du pH du tampon.
La différence pH - pHi détermine le signe de la charge Q d'une particule :
si pH > pHi charge nette négative (anion) migration vers l'anode
si pH < pHi charge nette positive (cation) migration vers la cathode
si pH = pHi charge nette nulle pas de migration
La différence pH - pHi détermine l'intensité de la charge Qd'une particule.
Etapes d’une électrophorèse
•Préparation du gel
•Préparation de la cuve et introduction du tampon
électrolyte
•Dépôt des échantillons
•Migration par application d’un champ électrique
•Révélation
Principe :
Une solution tampon, ou solution tamponnée, est une solution qui résiste aux variations de
pH lorsqu’on y ajoute de petites quantités d’acide ou de base.
Elle est généralement composée d’un acide faible et de sa base conjuguée, ou d’une
base faible et de son acide conjugué.
Les solutions tampons sont cruciales (très importants) dans de nombreux processus
biologiques et chimiques, Car elles maintiennent un pH stable, ce qui est essentiel
pour le bon fonctionnement des enzymes et d’autres réactions chimiques.
Par exemple: le système tampon bicarbonate dans le sang aide à réguler le pH sanguin.
tampon
-Un générateur du courant continu stabilisé relié aux électrodes de la cuve. Ce courant
crée un champ électrique qui va permettre de faire migrer les molécules.
-Une cuve d’électrophorèse fermée (horizontale ou verticale) et éventuellement
thermostatée comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du
Tampon de migration.
-Des accessoires comme le support d’électrophorèse, les plaques de verre pour couler
le gel et les peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composés à
analyser seront déposés.
Appareillage
Différents constituants d'électrophorèse
Electrophorèse sur papier
Les molécules à séparer sont déposées sur un support dont chaque extrémité est en contact
avec une solution tampon.
Dans chaque solution tampon se trouve une électrode. Les électrodes sont reliées à un
générateur de courant.
Lorsque le générateur envoie du courant, les molécules chargées se déplacent
sur le support en direction de l’électrode de signe opposé à leur charge.
Schéma simplifier de l’électrophorèse sur papier
Facteurs influençant la mobilité électrophorétique
Nature de la molécule
La taille et la charge de la molécule influencent le processus électrophorétique.
- En effet, les petites molécules migrent facilement mais leur mobilité dépend des
autres
substances dissoutes susceptibles de diminuer leur vitesse.
- Le signe de la charge détermine le sens de migration et sa vitesse.
Composition ionique du tampon d’électrophorèse
Un tampon de pH dont les ions conduisent le courant d’un pôle à un autre.
Support
Certains supports possèdent des propriétés adsorbants et peuvent fixer les molécules de
solvants ou de solutés. Il en résulte un ralentissement de la migration.
Champ électrique
Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu.
Types d’électrophorèse
Selon le support électrophorétique, il existe deux types d’électrophorèse:
L’électrophorèse peut être en des conditions non dénaturantes (natives) ou en
des conditions dénaturantes.
1. Electrophorèse en des conditions non dénaturantes
Les molécules sont séparées dans leur état le plus proche possible de leur état natif.
La vitesse de migration dépend de la charge native de la molécule et de sa structure.
2. Electrophorèse en des conditions dénaturantes
Les molécules sont soumises à un traitement dénaturant avant la séparation
électrophorétique, détruisant la structure native.
La séparation est en fonction de la masse moléculaire.
Exemple : l’agent de dénaturation SDS (Sodium Dodécyl Sulfate)
permettant de charger ainsi de séparer en fonction de la masse moléculaire les protéines).
3. Electrophorèse en veine liquide (électrophorèse libre)
Il s’agit de la première méthode élecrophorétique décrite.
La solution échantillon est placée dans un tube en forme Uet
recouverte d’une solution tampon de densité plus faible
que celle de l’échantillon.
Les électrodes sont placées dans le tube où l’on applique
le champ électrique.
La migration dans ce cas s’effectue au sein d’un liquide
constitué par une solution tampon dont les ions conduisent
le courant d’un pôle à un autre. Ce type de d’électrophorèse
présente de multiples inconvénients (Appareillage couteux,
mise en œuvre longue et délicate, séparation incomplète des
particules).
Types d’électrophorèse
Types d’électrophorèse
4. Electrophorèse de zone sur support
Les mobilités obtenues en ce type d’électrophorèse sont plus faibles que celles de
l’électrophorèse en veine liquide. Ce type utilise un support poreux stabilisant la phase liquide.
Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, homogène, poreux, inerte
Et imprégné de tampon.
Ce support peut être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de l’agarose,
du polyacrylamide PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis), etc.
Les différents types d’électrophorèse de zone sont souvent nommés en fonction
du type de support :
- Electrophorèse sur papier
- Electrophorèse sur acétate de cellulose
- Electrophorèse sur gel (amidon, agar, agarose, Polyacrylamide…).
Types d’électrophorèse
Montage horizontale Montage verticale
Exemples:
Électrophorèse sur gel
Mise en œuvre (sur gel):
Elle consiste à:
•Préparer le gel de concentration et le gel de séparation.
•Couler le gel de séparation entre des plaques de verre fixées sur un support suivi par le
gel de concentration.
•Déposer un peigne entre ces plaques.
•Retirer le peigne après formation des puits.
•Déposer l’échantillon et les marqueurs de masse moléculaire dans les puits.
•Placer les plaques de verre contenant le gel dans une cuve d’électrophorèse.
•Remplir la cuve avec le tampon de migration.
•Mettre en marche le générateur de courant.
•Enlever le gel à partir des plaques à la fin de la migration.
•Colorer puis décolorer le gel.
•Analyser le gel.
Types d’électrophorèse
Le gel de concentration est utilisé pour concentrer les échantillons avant leur séparation.
Il permet de rassembler les molécules d’intérêt dans une zone plus étroite, ce qui facilite
leur analyse.
Le gel de séparation est conçu pour séparer les biomolécules en fonction de leur taille
ou de leur charge.
Il permet une séparation plus précise des molécules après leur concentration.
Gel de concentration
Gel de séparation
